▲dmrt1基因定點(diǎn)突變半滑舌鰨遺傳雄魚與正常雄魚大小比較圖。

A、正常雌魚 B、正常雄魚 C、dmrt1基因定點(diǎn)突變的雄魚。

生物的性狀是由基因決定的。什么基因決定魚苗是雌的還是雄的，什么基因決定魚苗生長(zhǎng)的快慢，這個(gè)問題是困擾魚類遺傳工作者多年的科學(xué)問題，也是制約魚類性別控制技術(shù)發(fā)展的難題。

能不能準(zhǔn)確解析基因的功能，揭示魚類性別決定的奧秘？中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所（以下簡(jiǎn)稱“黃海水產(chǎn)研究所”）的陳松林團(tuán)隊(duì)取得突破性進(jìn)展：首次將基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于鲆鰈魚類，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨雄性決定基因，揭示雄魚“矮小”的奧秘，為半滑舌鰨遺傳改良開辟了一條新的途徑，這在國(guó)內(nèi)外還是首次。

全球首例：將基因編輯技術(shù)成功應(yīng)用于海水鲆鰈魚類

基因編輯是什么？作為近年來生命領(lǐng)域最重要的技術(shù)突破之一，它可以將基因組里任意一個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯、敲除，或者把外源基因定點(diǎn)植入，從而改變生物的性狀。

事實(shí)上，基因編輯技術(shù)近幾年已經(jīng)相繼在斑馬魚等模式魚類，以及羅非魚等淡水養(yǎng)殖魚類上成功應(yīng)用。但海水養(yǎng)殖魚類具有胚胎顯微注射技術(shù)難度大、仔魚數(shù)量過少難以培育成活等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)海水養(yǎng)殖魚類基因組編輯的成功報(bào)道。 “建立海水養(yǎng)殖魚類基因組編輯技術(shù)成為海洋生物技術(shù)和遺傳育種領(lǐng)域亟待攻克的重大課題。”陳松林表示。

鑒于此，陳松林團(tuán)隊(duì)自2013年開始，便專注于海水鲆鰈魚類基因組編輯技術(shù)的研究。經(jīng)過幾年的努力，團(tuán)隊(duì)成功建立了海水鲆鰈魚類-半滑舌鰨胚胎顯微注射技術(shù)及基因組編輯技術(shù)，并在性別決定基因功能驗(yàn)證上取得突破性進(jìn)展。

半滑舌鰨，俗稱“舌頭魚”，是一種典型的鲆鰈魚類。作為百姓最喜愛的食用魚類之一，半滑舌鰨成為我國(guó)海水魚類養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一，產(chǎn)業(yè)規(guī)模較大。但半滑舌鰨有個(gè)特點(diǎn)：雌性比雄性個(gè)體要大兩到四倍。陳松林介紹，作為食用魚類，解決這個(gè)問題有兩項(xiàng)選擇：培育全雌魚苗或改良雄魚性狀。由于半滑舌鰨的遺傳特性決定了培育其全雌苗種目前還難以實(shí)現(xiàn)，因此陳松林團(tuán)隊(duì)探索了后者的可行性。“雌、雄個(gè)體差異大為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了較好的對(duì)比；而將基因組編輯技術(shù)在這種魚類上應(yīng)用不僅有科學(xué)價(jià)值，也能在遺傳改良和性控育種上有突破性意義和應(yīng)用前景。”

陳松林介紹，基因組編輯技術(shù)主要是通過對(duì)受精卵進(jìn)行顯微注射這一技術(shù)手段完成。但半滑舌鰨的受精卵小，且浮性大，在水中漂浮而難以固定。為此，陳松林團(tuán)隊(duì)研制了特定的模具，用于固定受精卵，方便受精卵的顯微注射操作。而針對(duì)半滑舌鰨受精卵膜比較硬的特點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)改進(jìn)了顯微注射玻璃針的尖度和長(zhǎng)度，這樣比較容易注射到胚胎的動(dòng)物極。

克服了顯微注射的技術(shù)難點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)成功對(duì)雄性半滑舌鰨進(jìn)行了基因編輯，敲除了半滑舌鰨的雄性決定基因dmrt1，在獲得的dmrt1基因定點(diǎn)突變的雄魚中，有一些雄魚的平均體重為普通野生型雄魚的2.2倍，其生長(zhǎng)速度明顯高于野生型雄魚，接近野生型雌魚的大小。“這表明通過dmrt1基因定點(diǎn)突變有可能提高半滑舌鰨雄魚的生長(zhǎng)速度。”陳松林總結(jié)道。

揚(yáng)長(zhǎng)避短：通過分析基因功能，改良魚類經(jīng)濟(jì)性狀

此次將基因編輯技術(shù)成功應(yīng)用于鲆鰈魚類，除了最直接的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陳松林更看重其背后的意義：“基因編輯實(shí)驗(yàn)確定了dmrt1基因是半滑舌鰨的雄性決定基因，這表明基因編輯技術(shù)確實(shí)是分析基因功能的最有效手段，這也是基因編輯技術(shù)最重要的用途之一——分析和了解基因的功能。”

發(fā)掘基因資源的目的之一就是在海洋生物產(chǎn)業(yè)和海水養(yǎng)殖業(yè)以及良種培育中進(jìn)行利用，而基因功能的驗(yàn)證則是利用基因的前提。“事實(shí)上，全球科學(xué)家通過基因組測(cè)序，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多不同魚類的基因。但這些基因決定哪些性狀，發(fā)揮什么作用，還無法完全了解。”陳松林說。通過基因編輯技術(shù)，對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，觀察生物出現(xiàn)的表型性狀的改變，由此對(duì)該基因進(jìn)行功能鑒定及解析。

而這項(xiàng)研究將有非常大的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。陳松林介紹，對(duì)不同魚類的不同基因進(jìn)行功能確定后，可以揚(yáng)長(zhǎng)避短，通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行物種改良。對(duì)此，他舉例道：“比如通過基因編輯技術(shù)，敲除抑制生長(zhǎng)的基因，可以促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)；敲除易與病毒相結(jié)合的受體基因，使病毒在生物體上失去受體，可以提高魚體的抗病性能。”

同時(shí)陳松林表示，將內(nèi)源性的生長(zhǎng)抑制基因或致病基因等“不良”基因敲除，與“植入”外源基因的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不同，可以消除消費(fèi)者對(duì)外源基因食用安全性的顧慮。因而基因組編輯技術(shù)將在魚類高產(chǎn)抗病優(yōu)質(zhì)良種培育上具有重大應(yīng)用價(jià)值，特別是在觀賞魚類遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)制上具有重大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的推廣前景。

總體看來，對(duì)于基因組編輯技術(shù)，陳松林主要看好三個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景：在魚類乃至整個(gè)海洋養(yǎng)殖動(dòng)物的遺傳改良方面有重要應(yīng)用價(jià)值；可以對(duì)基因功能進(jìn)行鑒定和解析，從而揭示重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制；可以發(fā)現(xiàn)海洋生物中蘊(yùn)藏的藥用基因，在養(yǎng)殖和醫(yī)藥領(lǐng)域均有重要應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)基礎(chǔ)：首次完成半滑舌鰨全基因組測(cè)序

不是所有基因都會(huì)帶來性狀變化，該如何選定要進(jìn)行編輯的目標(biāo)基因？這就要靠基因組測(cè)序。基因組測(cè)序簡(jiǎn)單來說就是“基因解秘”，就是查明基因內(nèi)核苷酸的排列順序，陳松林形容它為“破譯基因密碼這本天書”。

事實(shí)上，在基因組編輯的“大風(fēng)”吹來之前，陳松林團(tuán)隊(duì)已經(jīng)于2011年完成了對(duì)半滑舌鰨魚類的全基因組測(cè)序工作。“我們完成了半滑舌鰨全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了兩萬一千多個(gè)基因。”陳松林說。“這是全球范圍內(nèi)完成全基因組測(cè)序的第一種鲆鰈魚類，同時(shí)也是國(guó)內(nèi)完成全基因組測(cè)序的第一種魚類。”這一成果獲得了2014年國(guó)家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)。正是基于半滑舌鰨全基因組解析的結(jié)果，團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了性別決定基因，并進(jìn)行了基因組編輯的研究。

事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)室的成功距離產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有一段路要走。陳松林介紹，在半滑舌鰨基因編輯魚苗的培育上，團(tuán)隊(duì)目前仍面臨著受精卵在顯微注射后成活率低至約千分之一、仔魚發(fā)育過程中死亡率高以及基因突變后的半滑舌鰨如何繁殖等等問題。但他同時(shí)表示，就目前來看，在半滑舌鰨上成功建立基因組編輯技術(shù)，對(duì)于其它海水養(yǎng)殖魚類基因功能分析技術(shù)平臺(tái)的建立和基因組編輯育種技術(shù)的開發(fā)都具有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值。